Probablemente nació en la ciudad de Mileto, ubicada en la región de Jonia, la que fuera sede de una escuela filosófica y literaria que dio nombres tan brillantes como Anaxímenes, Arctino, Ebulides y el célebre Tales (quienes adaptaron el gentilicio de Mileto como apellido), auténtico centro neurálgico de la cultura helenística del Siglo VI.

Trabajó al servicio de Justiniano, quien encargó a Antemio de Tralles la construcción de la "nueva iglesia de la Santa Sabiduría" (Hagia Sophia), comenzada en 532.

A pesar de ser su única obra, Santa Sofía es uno de los edificios más importantes del mundo, con una cúpula de treinta metros de diámetro. Antemio escogió como colaborador directo a Isidoro para concebir el proyecto, dar forma definitiva al edificio y comenzar su construcción.

Con el mismo nombre de Isidoro de Mileto se conoce al sobrino del anterior, quien se encargó de la reconstrucción del edificio después del terremoto ocurrido en la zona en el 557.

Por otra parte, existe una edición de los Elementos de Euclides, una recopilación de escritos de Arquímedes y un comentario del Tratado de las bóvedas que están firmados por Isidoro de Mileto, aunque no se sabe a ciencia cierta si fueron escritas por el tío o el sobrino.